评价臭氧氧化对林可霉素的效价削减效果研究
中国是世界上大的抗生素生产国，是青霉素、四环素和林可霉素等发酵类抗生素的主要生产基地[1]。在抗生素发酵生产过程中产生的废母液通常含有高浓度抗生素[2-4]，目前这些废母液主要是经生活污水稀释后，采用活性污泥法等常规生物工艺进行处理。抗生素作为一种抑菌或杀菌物质，可影响污水生物处理系统的功能[5]，并可能导致耐药菌及耐药基因的产生和排放[6]。为了有效处理上述含抗生素废水，需要在生物处理之前去除废母液中抗生素残留效价。强化水解技术已经被证明具有削减链霉素、螺旋霉素和土霉素等抗生素效价的有效性[7-9]。前期研究[10] 已表明林可霉素结构稳定，难以通过温度或 pH 调节加速其水解过程，强化水解技术无法经济、有效地应用于其实际生产废水的处理。为了保障林可霉素发酵废水的安全、高效处理，须开发相应有效的预处理技术。
大量研究表明，臭氧对水体中的硝基苯、酚类、氯化苯、多环芳香烃等有很好的去除效果[11]，并且已成功应用于印染和石化等工业废水的处理[12-18]。LIU 等[19] 考察了臭氧预处理土霉素实际废水的效果，发现土霉素废母液抗生素降解 50% 时消耗的臭氧量为 0.63 mg·mg−1 土霉素，处理后污水不再诱导后续生物处理单元耐药性发展。上述研究表明，臭氧氧化可以作为一种制药废水的预处理技术，然而，目前有关臭氧氧化处理林可霉素发酵废水的研究较少。
本研究以林可霉素发酵废水的高效预处理为目标，利用配水实验评价了臭氧氧化削减林可霉素效价的有效性，考察了共存基质和反应 pH 对林可霉素去除的影响，将臭氧预处理与厌氧生物处理技术耦合，处理实际林可霉素发酵废水，讨论了臭氧预处理对废水生化处理的促进效果，以期为林可霉素废水的处理提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验材料
盐酸林可霉素 (98.0%) 购自上海 TCI 试剂公司。乙腈 (99.8%，加拿大 CALEDON 试剂公司)、甲醇 (99.9%，德国 CNW 试剂公司) 和甲酸 (99.9%，德国 CNW 试剂公司) 均为色谱纯，超纯水电导率为 18.2 Ω·cm−1。LB 培养基由酵母提取物 5 g、蛋白胨 10 g、琼脂 20 g 和 1 000 mL 超纯水配制而成。
1.2 实验方法
实验装置见图 1。臭氧由臭氧发生器产生，臭氧氧化实验在一个直径 40 mm、高度为 600 mm、容量为700 mL 的玻璃柱内进行，实验时将 100 mg·L−1的 500 mL 抗生素溶液一次性转入反应器中，臭氧是由玻璃柱底部的砂板进入反应体系，所有实验在恒温 (25 ℃) 条件下进行。臭氧的浓度由臭氧监测器进行监控，并用碘量法对臭氧浓度进行校正，反应后的残余臭氧由 5% 的 KI 溶液吸收。臭氧浓度稳定后开始计时，在不同反应时间从取样口取 4 mL 样品进行指标测试。
臭氧氧化反应装置示意图
1.3 测试及计算方法
林可霉素浓度测定采用超高效液相色谱-串联质谱法 (UPLC-MS/MS) 方法，色谱柱为 ACQUITYUPLC BEH Shield RP18(1.7 μm × 2.1 mm × 100 mm，沃特世，美国)；柱温为 35 ℃；流速为 0.3 mL·min−1；进样量 5 μL；流动相 A 为乙腈，流动相 B 为 0.1% 甲酸水。梯度洗脱程序参考文献中的方法[20]。电离方式为电喷雾电离 (ESI，正离子模式)，扫描方式为多反应监测 (MRM)，毛细管电压为 1.0 kV，离子源温度为 150 ℃，脱溶剂温度为 500 ℃，碰撞气流量为 50 L·h−1，脱溶剂气流量为 600 L·h−1。林可霉素母离子的 m/z 为 406.9，子离子的 m/z 为 125.9(定量离子) 和 359(定性离子)，锥孔电压为 30 V，碰撞电压为 25 V 和 22 V。
抗生素效价是指某一物质或水样产生抑菌效果的功效单位。本实验采用实验室前期建立的方法[21] 测定水样的抗生素效价，步骤如下：采用金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 作为标准菌株，分别采用废水中相应的抗生素和参照标准抗生素作标准曲线，测得相应的抗生素效价当量。
1 mL 的抗生素标准溶液或者待测样品与 9 mL 菌液混合，分别为标准曲线组和待测样品组，同时设置了 1 mL 磷酸盐缓冲液 (PBS) 和 9 mL 菌液混合作为阳性对照，1 mL PBS 和 9 mL 不加菌液的抗生素Ⅲ号培养基混合作为空白对照。在 WBS-100 微生物浊度法测定仪中 37 ℃ 条件下培养 4 h，间歇振荡，从 45 min 后每 10 min 测定 580 nm 下的光密度，光密度强弱反映细菌的生长情况。实验结束后，得到 20 组监测数据，根据标准曲线的线性相关系数选择标准曲线相关性高的一组数据，并根据此标准曲线计算样品的效价当量。所有样品的效价测定均为 3 个平行，计算平均值。
使用便携式 pH 计 (WTW-pH-Meter Multiline P4，德国) 测定 pH。使用 Phoenix 8000 总有机碳分析仪 (Teledyne Tekmar，美国) 测定溶解性有机碳 (DOC)。化学需氧量 (COD) 采用快速消解分光光度法[22] 测定。
1.4 抗生素臭氧氧化动力学
臭氧氧化反应包括直接反应和间接反应，反应过程复杂。本研究中臭氧连续通入，可认为在整个反应过程中臭氧是持续过量的，因此，反应过程可按照一级反应动力学[23-24] 模拟。
一级反应动力学速率方程如式 (1) 所示。
式中：r 为反应动力学速率；C 为抗生素浓度，mg·L−1；t 为反应时间，min；k 为反应速率常数，min−1；基于初始变量 t=0，C=C0，分离变量、积分，则得一级反应动力学方程 (如式 (2) 和式 (3) 所示)。
式中：C0 为抗生素初始浓度，mg·L−1；Ct 为抗生素在 t 时刻的浓度，mg·L−1；k 为一级反应动力学常数，min−1。
1.5 厌氧可生化性评价方法
厌氧可生化性实验在 Bioprocess Control(瑞典) 的甲烷自动测试系统 (AMPTS-Ⅱ) 中进行。实验所用厌氧污泥取自北京市高碑店城市污水处理厂剩余污泥处理单元的中温厌氧消化池。实验在一个 500 mL 的样品瓶中进行，每个样品瓶盛入 200 mL消化污泥 (VSS=2 000 mg·L−1)，分别加入 200mL 空白 (不加抗生素的溶液)、未处理过的林可霉素废水 (林可霉素浓度为 1 000 mg·L−1)、臭氧处理后的林可霉素废水 (林可霉素浓度为 4 mg·L−1)，其中对照组中的化学需氧量 (COD) 与实际废水的 COD(7 800 mg·L−1) 相同，由醋酸钠溶液配制，所有实验组均设置 2 个平行。实验前溶液初始 pH 用盐酸和氢氧化钠溶液调至 7.00±0.05，氮吹 3 min，将处理好的样品瓶置于恒温 ((35 ± 1) ℃) 水浴锅中。
谷永1，2，田哲1，3，唐妹1，3，苑宏英2，杨敏1，3，张昱1，3，*
1. 中国科学院生态环境研究中心，环境水质学国家重点实验室，北京 100085
2. 天津城建大学环境与市政工程学院，天津 300384
3. 中国科学院大学，北京 100049
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